Pregabalin är inte en GABAA- eller GABAB-receptoragonist.
Pregabalin är en gabapentinoid och verkar genom att hämma vissa kalciumkanaler.Specifikt är det en ligand av det extra α2δ-subenhetsstället för vissa spänningsberoende kalciumkanaler (VDCCs), och fungerar därigenom som en inhibitor av α2δ-subenhetsinnehållande VDCCs.Det finns två läkemedelsbindande α2δ-subenheter, α2δ-1 och α2δ-2, och pregabalin visar liknande affinitet för (och därmed brist på selektivitet mellan) dessa två ställen.Pregabalin är selektivt i sin bindning till α2δ VDCC-subenheten.Trots det faktum att pregabalin är en GABA-analog binder det inte till GABA-receptorerna, omvandlas inte till GABA eller någon annan GABA-receptoragonist in vivo och modulerar inte direkt GABA-transport eller metabolism.Emellertid har pregabalin visat sig ge en dosberoende ökning av hjärnexpressionen av L-glutaminsyradekarboxylas (GAD), enzymet som är ansvarigt för att syntetisera GABA, och kan därför ha vissa indirekta GABAergiska effekter genom att öka GABA-nivåerna i hjärnan.Det finns för närvarande inga bevis för att effekterna av pregabalin förmedlas av någon annan mekanism än hämning av α2δ-innehållande VDCC.I enlighet härmed verkar hämning av α2δ-1-innehållande VDCC av pregabalin vara ansvarig för dess antikonvulsiva, analgetiska och anxiolytiska effekter.
De endogena α-aminosyrorna L-leucin och L-isoleucin, som liknar pregabalin och de andra gabapentinoider i kemisk struktur, är skenbara ligander av α2δ VDCC-subenheten med liknande affinitet som gabapentinoider (t.ex. IC50 = 71 nM för L- isoleucin), och finns i human cerebrospinalvätska i mikromolära koncentrationer (t.ex. 12,9 μM för L-leucin, 4,8 μM för L-isoleucin).Det har teoretiserats att de kan vara de endogena liganderna i subenheten och att de kompetitivt kan antagonisera effekterna av gabapentinoider.I enlighet med detta, medan gabapentinoider som pregabalin och gabapentin har nanomolära affiniteter för α2δ-subenheten, är deras potenser in vivo i det låga mikromolära området, och konkurrens om bindning av endogena L-aminosyror har sagts vara ansvarig för denna avvikelse.

Pregabalin visade sig ha 6 gånger högre affinitet än gabapentin för α2δ-subenhetsinnehållande VDCCs i en studie.En annan studie fann emellertid att pregabalin och gabapentin hade liknande affiniteter för den humana rekombinanta α2δ-1-subenheten (Ki = 32 nM respektive 40 nM).I alla fall är pregabalin 2 till 4 gånger mer potent än gabapentin som smärtstillande och, hos djur, verkar det vara 3 till 10 gånger mer potent än gabapentin som ett antikonvulsivt medel.